PCR

  PCRیا واکنش زنجیره‎ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)، تکنیکی است که با استفاده از آن می‎توان در مدت‎زمان کوتاه یک قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون‌ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است یک ژن، بخشی از یک کروموزوم یا بخش‌هایی از ژنوم یک موجود باشد.

البته در تکثیر DNA با روش PCR، محدودیت‌هایی نیز وجود دارد که مهم‎ترین آن‎ها اندازه قطعات قابل تکثیر می‌باشد؛ به‎طور‌ی که حداکثر اندازه قطعه‌هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می‌گردد، 5000 نوکلئوتید (5 kb) و در روش‌های بهینه‎شده تا 20هزار نوکلئوتید (20 kb) می‎باشد.

با این تعریف، PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می‌کند که به وسیله آن می‌توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیرنمود.

درموجودات زنده، مجموعه‌ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانندسازی DNA نقش‎دارند. درحالی‎که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده‎می‎شود.

مخترع واکنش  PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می‎باشد که درسال 1983 این روش را جهت تکثیر  DNA معرفی‎کرد. قبل از این کشف، ساخت قطعات  DNA با روش‌های کند و پرهزینه شیمیایی انجام می‎گرفت. به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست‌شناسی ‌مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت‎کرد.

واکنش PCR به‎طور روزمره در اکثر آزمایشگاه‎های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می‎شود و در موارد بسیاری مثل شناسایی و جداسازی ژن‌ها، کلونینگ، طبقه‌بندی و شناسایی موجودات زنده، تشخیص بیماری‌های ژنتیکی و حتی پرونده‌های جنایی و تعیین‎هویت کاربرد دارد. در حال حاضر و نزدیک به 30  سال پس از کشف PCR، تحقیقات ژنتیک مولکولی بدون استفاده از این تکنیک قابل تصور نیست.

 

اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته‌ای، تغییرات دمایی است. در ابتدا، پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت «94-95 درجه سلسیوس» شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می‌شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می‎شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک‎رشته‌ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA موردنظر، برای تکثیر طراحی و ساخته شده‌‌اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی‌های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می‌گردند. این دو قطعه انتهای ¢3 آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می‌نماید، کاری که در همانند‌‌سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پرایماز و توالی اولیه ساخته‎شده توسط آن انجام می‎گیرد. درمرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می‎پذیرد. این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می‎شود؛ که به آن چرخه‌های PCR می‎گویند.

مرحله اول: واسرشت‏سازی Denaturation)،30تا 60 ثانیه)

عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA

مرحله دوم: اتصال Annealing)،30تا 60 ثانیه)

عمل انجام‎شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA

مرحله سوم: گسترش (ExtensionیاElongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه

عمل انجام‎شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر

اجزای واکنش PCR:

در یک واکنش PCR، از نمونه DNA، آنزیمTaq polymerase، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب حضور استفاده می‎شود.

کاربردهای Real Time PCR  :

1. تعیین تعداد کپی از هر ژن

2. سنجش میزان بیان ژن 

3. سنجش ویروس‎ها

4. اندازه‎گیری میزان آسیب به DNA

5. پیگیری نتایج پیوند عضو

6. پیگیری نتایج، پس از پیوند سلول‎های بنیادی خون‎ساز

7. بررسی انواع تریزومی

8. تشخیص سرطان در حین عمل جراحی

9. تشخیص قبل از تولد و تعیین جنسیت با استفاده از سلول‎های جدا شده از خون مادر

و بسیاری موارد دیگر . 

نویسنده : امید پوراسماعیل